구릿대(Angelica dahurica) 잎의 쿠마린 성분

구릿대(Angelica dahurica)는 산형과(Apiaceae)에 속하는 2~3년 초로 우리나라를 비롯한 동북아시아에 분포한다.¹⁾ 우리나라, 중국 등의 전통의학에서는 구릿대의 뿌리를 백지(白芷)라 하여 거풍제습(去風除濕), 통규지통(通竅止痛), 소종배농(排膿消腫)의 효능이 있어 감모(感冒), 두통(頭痛), 미릉골통(眉稜骨痛), 아통(牙痛), 비색(鼻塞), 비연(鼻淵), 부녀자의 백대(白帶) 등의 치료에 이용하고 있다.^2,3) 백지의 성분으로는 coumarin계열의 화합물 들이 분리, 보고되고 있으며,^4-8) 활성으로는 항균활성,⁷⁾ acetylcholinesterase 억제활성,⁹⁾ 파골세포 분화억제활성,¹⁰⁾ 간섬유화 억제활성,¹¹⁾ 당뇨환자의 상처 치유 증강효과¹²⁾ 등의 활성이 보고되는 등 매우 활발한 연구가 이루어지고 있다. 이상에서 살펴본 바와 같이 전통의학에서 중요하게 사용되고 있는 구릿대(A. dahurica)는 약재로 이용되고 있는 뿌리를 중심으로 연구가 이루어지고 있는 실정이므로 본 연구자 등은 줄기나 잎 등과 같은 이 식물의 모든 부위에 대한 성분 상을 밝히고자 계속되는 연구를 수행하고 있으며 그 결과로 줄기로부터 수종의 coumarin과 chromone계열의 화합물을 분리하여 보고한 바 있다.^13,14) 한편, 구릿대(A. dahurica)의 어린잎은 일부 지역에서 식용하는 것으로 알려져 있으며,¹⁾ 잎에 관한 연구로는 김 등이¹⁵⁾ GC-MS 분석을 통하여 잎의 정유 성분을 분석하여 보고하였으며, 이는^16,17) 잎 추출물의 항산화 효과와 단백질 등의 함량을 측정하여 보고하였을 뿐 뿌리와 줄기에 다량 함유되어 coumarin이나 chromone 등에 관한 연구는 찾아보지 못하였다. 이에 저자 등은 구릿대(A. dahurica)의 잎 추출물 중 chloroform 분획을 대상으로 성분을 분리하고 그 구조를 밝힘과 동시에 자원으로의 사용 가능성을 알아보기 위하여 연구에 착수하고 6종의 화합물을 분리하고 그 구조를 밝혔기에 이를 보고하고자 한다.

재료 및 방법

실험재료 – 실험에 사용한 구릿대(A. dahurica)의 잎은 2016년 8월 정선군 일대에서 채집하여 강원대학교 약학대학 권용수 교수가 정확하게 감정한 후 음건하였다. 확증표본(KNUH-L-1608-1)은 강원대학교 약학대학 생약학 연구실에 보관 중이다.

기기 및 시약 – Mass spectra는 Waters사의 Micromass Quattro micro API 또는 Jeol사의 JMS-700 mass spectrometer를 이용하여 측정하였다. NMR spectra는 Jeol사의 JNM-ECZ500R을 이용하여 측정하였다. 선광도는 Jasco사의 DIP-1000 digital polarimeter를 이용하여 측정하였다. 화합물의 분리는 Merck사의 silica gel (63~200μm 또는 40~63μm)과 YMC 사의 ODS (ODS-A, 150 또는 75μm)를 이용한 open column chromatography와 Teledyne Isoco사의 CombiFlash^® Flash chromatography system을 이용하여 RediSep^® column으로 수행하였다. Gel filtration은 Amersham Biosciences사의 Sephadex LH20을 사용하였다. TLC 분석은 Merck사의 Kieselgel 60 F₂₅₄와 RP F_254s plates를 사용하였다. Chromatography에 사용한 유기 용매는 따로 언급이 없는 한 대정화금사의 extra pure grade를 한번 증류한 것을 사용하였다. 기타 시약은 analytical grade를 사용하였다.

추출 및 분리 – 음건하여 잘게 자른 구릿대(A. dahurica)의 잎 1.3 kg에 MeOH 18 L를 가하고 실온에서 1주일간 2회 추출한 후 여과하고 여액을 40℃에서 감압농축하여 MeOH 분획 144 g을 얻었다. 얻어진 MeOH 분획(140 g)을 증류수에 현탁시키고 n-hexane, CHCl₃ 및 n-BuOH의 순으로 분획하고 감압 농축하고 n-hexane 분획 8 g, CHCl₃ 분획 30 g 및 n-BuOH 분획 37 g을 얻었다. Chloroform 분획 27 g을 silica gel (63-200 μm, 800 g) column (9.5 × 50 cm)에 걸고 CHCl₃:MeOH (29:1)을 용매로 용출시킨 후 TLC 분석을 통하여 일곱 개의 분획(ADL-1~ADL-7)으로 나누었다. 분획 ADL-2 (4 g)를 RediSep^® silica gel column (80 g)을 사용하여 CHCl₃:MeOH (49:1)을 용매로 flash column chromatography를 실시하고 세 개의 분획(ADL-2-1~ADL-2-3)으로 나누었으며, 이 중 분획 ADL-2-1 (1.9 g)을 RediSep^® silica gel column (40 g)을 사용하여 n-hexane:EtOAc (7:1)을 용매로 flash column chromatography를 실시하고 다섯 개의 소분획(ADL-2-1-1~ADL-2-1-5)로 나누고, 소분획 ADL-2-1-3 (0.9 g)을 RediSep^® C18 column (40 g)을 이용하여 MeOH:H₂O (60:40) 용액을 용매로 정제하여 화합물 1 (86 mg)을 얻었다. 분획 ADL-3 (15.4 g)을 ODS (150 μm, 200 g) column (4.8 × 50 cm)에 걸고 MeOH:H₂O (70:30)을 용매로 용출시켜 일곱 개의 분획(ADL-3-1~ADL-3-7)으로 나누었다. 이 중 분획 ADL-3-1 (450 mg)을 n-hexane/EtOAc로 재결정하여 화합물 2 (150 mg)를 얻었다. 분획 ADL-3-2 (11 g)를 RediSep^® silica gel column (130 g)을 사용하여 n-hexane:EtOAc (7:1)을 용매로 flash column chromatography를 실시하고 여섯 개의 분획(ADL-3-2-1~ADL-3-2-6)으로 나누었다. 분획 ADL-3-2-2 (6.5 g)을 RediSep^® silica gel column (80 g)을 사용하여 CHCl₃:MeOH (79:1→ 59:1)을 용매로 flash column chromatography를 실시하고 여섯 개의 소분획(ADL-3-2-2-1~ADL-3-2-2-6)으로 나누었다. 소분획 ADL-3-2-2-1 (1.8 g)을 silica gel (40~63 μm, 200 g) column (4.8 × 50 cm)에 걸고 n-hexane:EtOAc (2:1)로 용출시켜 화합물 3 (94 mg)과 4 (144 mg)을 얻었다. 소분획 ADL-3-2-2-5 (510 mg)을 Sephadex LH20 (40 g) column (2 × 50 cm)에 걸고 MeOH:H₂O (40:40)를 용매로 용출시켜 네 개의 소분획 (ADL-3-2-2-5-1~ADL-3-2-2-5-4)으로 다시 나누었다. 소분획 ADL-3-2-2-5-2 (340 mg)을 대상으로 CHCl₃:MeOH (79:1)을 용매로 silica gel (40~63 μm, 80 g) column (2 × 50 cm) chromatography를 반복 실시하여 화합물 5 (41 mg)와 6 (83 mg)을 얻었다.

Imperatorin (1) – White needle; ¹H-NMR (CDCl₃, 500 MHz) δ: 7.75 (1H, d, J=9.5 Hz, H-4), 7.67 (1H, J=2.0 Hz, H-2′), 7.34 (1H, s, H-5), 6.79 (1H, d, J=2.0 Hz, H-3′), 6.34 (1H, J=9.5 Hz, H-3), 5.59 (1H, t, J=7.0 Hz, H-2″), 4.98 (2H, d, J=7.0 Hz, H-1″), 1.72 (3H, s, CH₃-4″), 1.70 (3H, s, CH₃-5″); ¹³C-NMR (CDCl₃, 125 MHz) δ: see Table Ⅰ; ESI-MS m/z: 270 [M+H]⁺.

Table Ⅰ.

13C-NMR chemical shifts of compounds 1-6a)

Scopoletin (2) – White neelde; ¹H-NMR (CDCl₃, 500 MHz) δ: 7.60 (1H, d, J=9.4 Hz, H-4), 6.92 (1H, s, H-5), 6.85 (1H, s, H-8), 6.27 (1H, d, J=9.4 Hz, H-4), 3.95 (3H, s, OCH₃); ¹³C-NMR (CDCl₃, 125 MHz) δ: see Table Ⅰ; ESI-MS m/z: 193 [M+H]⁺.

Hopeyhopin (3) – White powder; ¹H-NMR (CDCl₃, 500 MHz) δ: 8.04 (1H, s, H-5), 7.70 (1H, 1H, d=9.4 Hz, H-4), 6.90 (1H, s, H-8), 6.32 (1H, d, J=9.4 Hz, H-3), 4.04 (1H, s, H-2′), 4.03 (3H, s, OCH₃), 1.55 (3H, s, CH₃-4′), 1.25 (3H, s, CH₃-5′); ¹³C-NMR (CDCl₃, 125 MHz) δ: see Table 1; EI-MS m/z (rel. int.): 274 [M]⁺ (98.8), 204 (100), 189 (26.4), 175 (67.6), 160 (52.0), 89 (33.1).

Agnelol A (4) – White gum; [α]_D²¹ (c 0.23, MeOH): -93.2°; ¹H-NMR (CDCl₃, 500 MHz) δ: 7.55 (1H, d, J=9.4 Hz, H-4), 7.53 (1H, s, H-5), 6.67 (1H, s, H-8), 6.15 (1H, d, J=9.4 Hz, H-3), 5.81 (1H, m, H-3″), 5.57 (1H, d, J=1.5 Hz, H-1′), 5.07 (1H, d, J=1.5 Hz, H-2′), 3.86 (3H, s, OCH₃), 1.70 (3H, br t, J=1.5 Hz, CH₃-5″), 1.60 (3H, dd, J=7.0, 1.5 Hz, CH₃-4″), 1.50 (3H, s, CH₃-4′), 1.18 (3H, s, CH₃-5′); ¹³C-NMR (CDCl₃, 125 MHz) δ: see Table Ⅰ; ESI-MS m/z: 377 [M+H]⁺.

Angelol I (5) – White powder; [α]_D²¹ (c 0.27, MeOH): -107.2°; ¹H-NMR (CDCl₃, 500 MHz) δ: 7.61 (1H, d, J=9.4 Hz, H-4), 7.60 (1H, s, H-5), 6.73 (1H, s, H-8), 6.22 (1H, d, J=9.4 Hz, H-3), 5.59 (1H, d, J=1.5 Hz, H-1′), 5.09 (1H, d, J=1.5 Hz, H-2′), 3.90 (3H, s, OCH₃), 2.05 (1H, dd, J=15.0, 7.0 Hz, H-2″a), 1.92 (1H, dd, J=15.0, 7.0 Hz, H-2″b), 1.80 (1H, m, H-3″), 1.54 (3H, s, CH₃-4′), 1.21 (CH₃-5′), 0.70 (3H, d, J=6.5 Hz, CH₃-4″), 0.60 (3H, d, J=6.5 Hz, CH₃-5″); ¹³C-NMR (CDCl₃, 125 MHz) δ: see Table Ⅰ; ESI-MS m/z: 377 [M-H]^-.

Angelol E (6) – White gum; [α]_D²¹ (c 0.38, MeOH): -48.1°; ¹H-NMR (CDCl₃, 500 MHz) δ: 7.61 (1H, d, J=9.5 Hz, H-4), 7.47 (1H, s, H-5), 6.77 (1H, s, H-8), 6.24 (1H, d, J=9.5 Hz, H-3), 5.20 (1H, d, J=9.0 Hz, H-2′), 5.16 (1H, d, J=9.0 Hz, H-1′), 3.93 (3H, s, OCH₃), 1.91 (1H, dd, J=17.5, 9.5 Hz, H-2′a), 1.50 (2H, m, H-2′b, H-3′), 1.38 (3H, s, CH₃-4′), 1.21 (3H, s, CH₃-5′), 0.70 (3H, d, J=6.5 Hz, CH₃-4″), 0.61 (3H, d, J=6.5 Hz, CH₃-5″), ¹³C-NMR (CDCl₃, 125 MHz) δ: see Table I; ESI-MS m/z: 377 [M-H]^-.

결과 및 고찰

화합물 1, 2 및 3은 NMR, MS 등의 분석결과를 종합하고 문헌^{8), 18), 19)}과 비교하여 imperatorin, scopoletin 및 hopeyhopin으로 동정하였다. 화합물 4의 ¹H-NMR spectrum의 δ 7.55와 6.15에서 나타나는 J=9.4 Hz의 doublets, δ 7.53과 6.67에서 나타나는 singlet들로부터 이 화합물은 6번과 7번에 치환기가 존재하는 simple coumarin임을 알 수 있으며,²⁰⁾δ_H 5.57와 5.07에서 나타나는 J=1.5 Hz의 doublets, δ_H 1.50과 1.18에서 나타나는 methyl기에 의한 각각의 singlet들과 δ_C 75.48, 74.11, 67.24, 27.56 및 26.38에서 나타나는 signal들로부터 이 화합물에는 한 개의 trihydroxyisopentyl기가 존재함을 알 수 있었고, δ_H 5.81에서 나타나는 multiplet, 1.70에서 나타나는 methyl기에 의한 J=1.5 Hz의 broad triplet와 1.60에서 J=7.0, 1.5 Hz로 나타나는 methyl에 의한 signal들과 δ_C 166.57, 137.49, 127.12, 20.24 및 15.24에서 나타나는 signal들로부터는 angeloyl기가 존재함을 알 수 있었다. 또한 δ_H 3.86과 δ_C 56.03에서 한 개의 methoxyl기의 존재를 확인할 수 있었다. 이상이 결과들로부터 이 화합물은 전형적인 angelol-type의 coumarin 계열의 화합물임을 알 수 있었으며,²¹⁾ 치환기의 치환위치를 결정하기 위하여 HSQC, HMBC 등의 스펙트럼 분석을 실시하였다. HMBC spectrum 분석에서 δ_H 3.86에서 나타나는 methoxyl기는 δ_C 158.97의 signal과 cross peak를 나타내므로 methoxyl기는 7번 위치에 치환되어 있음을 알 수 있었고, δ_H 5.57에서 나타나는 J=1.5 Hz의 doublet은 δ_C 158.97, 126.50 및 74.11의 signal들과 cross peak를 나타내므로 isopentyl기는 6번 위치에 치환되어 있음을 알 수 있었다. 또한 δ_H 5.07에서 나타나는 J=1.5 Hz의 doublet은 δ_C 166.57과 126.50의 signal들과 cross peak를 나타내므로 angeloyl기는 isopentyl의 2번 위치에 치환되어 있음을 알 수 있었다. Trihydroxyiospentyl기의 절대배치는 선광도 값과 ¹H-NMR을 이용하여 결정할 수 있었다. 즉, 589 nm에서 측정한 선광도의 값이 –93.2°로 나타나므로 isopentyl기의 1번위치의 절대배치는 R-configurarion임을 알 수 있고,²²⁾ 1번과 2번 proton의 coupling constant 값이 J=1.5 Hz로 나타나므로 이들 proton들은 erythro로 배위하고 있음을 알 수 있으므로 2번의 절대배치는 S-configuration임을 알 수 있었다.²³⁾ 이상의 결과를 문헌^21,22) 화합물 4를 anglol A로 동정하였다. 화합물 5의 ¹H-NMR spectrum을 보면 δ 7.61과 6.22에서 J=9.4 Hz로 나타나는 doublets, δ 7.60과 6.73에서 나타나는 각각의 singlet 그리고 δ 3.90에서 methoxyl기에 의한 singlet을 확인할 수 있었다. 또한 NMR spectra의 δ_H 5.59와 5.09에서 나타나는 J=1.5 Hz의 doublets, δ_H 1.54와 1.21에서 나타나는 methyl기에 의한 singlet들과 δ_C 75.48, 74.43, 67.52, 27.84 및 26.25에서 나타나는 탄소의 signal들로부터 이 화합물도 화합물 4와 같은 angelol-type의 화합물임을 알 수 있었다. 하지만 이 화합물은 화합물 4와는 다르게 δ_H 2.05와 1.92에서 각각 나타나는 J=15.0, 7.0 Hz의 doublet of doublets, 1.80에서 나타나는 multiplet, 0.70과 0.60에서 나타나는 각각의 methyl기에 의한 J=6.5 Hz의 doublet들과 δ_C 171.79, 42.71, 25.17, 22.07 및 22.05에서 나타나는 탄소의 signal들로부터 angleloyl기가 아닌 isovaleryl기가 치환되어 있음을 알 수 있었다.²¹⁾ HMBC spectrum 분석을 통하여 isovaleryl기의 치환 위치를 확인할 수 있었다. 즉, δ_H 5.09에서 J=1.5 Hz의 doublet으로 나타나는 signal이 δ_C 171.79, 126.32에서 나타나는 탄소 signal들과 cross peak를 나타내므로 isovaleryl기는 trihydroxyiospentyl기의 2번 위치에 치환되어 있음을 알 수 있었다. Trihydroxyisopentyl기의 절대배치는 589 nm에서 측정한 선광도의 값이 –107.2°로 나타나고, 1번과 2번의 proton이 ¹H-NMR spectrum의 δ 5.59와 5.09에서 J=1.5 Hz의 doublet으로 나타나므로 두 proton은 erythro의 배위를 하고 있음을 알 수 있었으므로, 이 화합물도 1R, 2S의 절대배치를 가지는 것을 알 수 있었다. 이상의 결과와 문헌^{14), 24)}을 비교하여 화합물 5를 alngelol I로 동정하였으며 이 과정에서 문헌¹⁴⁾에 기재된 3번과 6번 탄소의 chemical shifts가 바뀌었음을 알고 바로 잡았다. 화합물 6의 ¹H-NMR spectrum을 보면 δ 7.61과 6.24에서 J=9.5 Hz로 나타나는 doublets, δ 7.47과 6.77에서 나타나는 각각의 singlet 그리고 δ 3.90에서 methoxyl기에 의한 singlet을 확인할 수 있었다. NMR spectra의 δ_H 5.20과 5.16에서 나타나는 J=9.0 Hz의 doublets, δ_H 1.38과 1.21에서 나타나는 methyl기에 의한 singlet들과 δ_C 76.85, 73.33, 70.10, 27.68 및 24.49에서 나타나는 탄소의 signal들과 더불어 δ_H 1.91에서 각각 나타나는 J=17.5, 9.5 Hz의 doublet of doublets, 1.50에서 나타나는 두 개의 proton에 의한 multiplet, δ_H 0.70과 0.61에서 나타나는 각각의 methyl기에 의한 J=6.5 Hz의 doublet들과 δ_C 171.25, 42.30, 25.11, 22.10 및 22.01에서 나타나는 탄소의 signal들을 확인할 수 있었는데 이는 화합물 5의 그것들과 매우 유사함을 알 수 있었는데 이로부터 이 화합물은 화합물 5의 stereoisomer로 추정하였다. 한편, Kozawa 등은 trihydroxyisopentyl기의 1번과 2번의 proton이 1H NMR specturm의 δ 5.15~5.20에서 나타날 경우 acyl group이 2번 위치에 치환되고, 두 proton은 threo form으로 배위한다고 보고하였다.²⁴⁾ 이 화합물은 1H NMR specturm의 δ 5.20에서 2번 proton이 δ 5.16에서 1번의 proton이 각각 J=9.0 Hz의 doublet으로 나타나므로 threo form임을 확인할 수 있었고, HMBC spectrum의 δ_H 5.20에서 나타나는 2번 proton이 δ_C 171.25, 125.93 및 73.33에서 나타나는 탄소의 signal들과 cross peak를 나타내므로 isovaleryl기는 2번 위치에 치환되어 있음을 확인할 수 있었다. 또한, 589 nm에서 측정한 선광도의 값이 –48.1°로 나타났으므로 trihydroxyisopentyl기 1번의 절대배치는 R-configuration임을 알 수 있었고, 이에 따라 2번의 절대배치도 R-configurarion으로 결정할 수 있었다. 이상의 결과를 문헌^21,23)과 비교하여 화합물 6을 angelol E로 동정하였다. 이 화합물도 구조를 결정하는 과정에서 문헌²¹⁾의 3번과 6번 탄소의 chemical shifts가 바뀌어 있는 것을 확인하고 이를 바로잡았다. 이상에서 구조를 결정한 화합물들의 활성에 관한 연구를 살펴보면 imperatorin (1)은 가려움증 억제효과,²⁵⁾ 폐섬유화 개선효과,²⁶⁾ 항산화효과,²⁷⁾ 항염증효과,²⁸⁾ 괴양성 대장염 완화효과,²⁹⁾ 등 매우 다양한 활성이 연구 보고 되었으며, scopoletin (2)의 활성으로 최근에 발표된 것들로는 인지능 개선효과,³⁰⁾ 고지혈증 개선효과,³¹⁾ 난소암 진행 억제효과,³²⁾ 심장보호효과,³³⁾ 췌장보호효과,³⁴⁾ 고혈당 유래 독성의 경감효과,³⁵⁾ 뼈 손실 억제효과,³⁶⁾ 등 매우 다양한 활성이 보고되었다. Hopeyhopin (3)의 활성으로 항암활성³⁷⁾이 보고되었고, angelol A (4)의 활성으로는 항암효과,³⁸⁾ prostate specific antigen 분비억제효과²²⁾가 보고 되었다. Angelol I (5)와 angelol E (6)의 활성에 관한 연구는 찾아 볼 수 없었다.

Fig. 1.

Structures of compounds 1-6.

결 론

구릿대(Angelica dahurica)의 잎에 함유된 성분을 분리하고 그 구조를 밝혀 Angelica속 식물의 성분 분류학적 자료를 제시함과 더불어 자원으로서의 사용가능성을 알아보기 위하여 연구에 착수하고 그 MeOH 추출물 중 chloroform 가용성 분획에 대한 성분 분리연구를 실시하여 6종의 화합물을 분리한 후 NMR, MS, 선광도 등을 측정하고 문헌과 비교하여 분리된 화합물의 구조를 imperatorin (1), scopoletin (2), hopeyhopin (3), angelol A (4), angelol I (5) 및 angelol E (6)으로 동정하였다. 이들 화합물 중 angelol A (4)와 angelol E (6)는 이 식물로부터는 처음으로 분리된 것 들이었다. 이상의 결과로부터 구릿대(A. dahurica)의 잎도 성분 분류학을 위한 기초자료나 활성연구를 위한 자료로 사용할 수 있을 것으로 생각된다.

Acknowledgments

이 연구는 강원대학교 약학대학 전공심화연구 프로그램에 의해 수행되었으며, 핵자기공명분광기는 강원대학교 항암혁신신약개발 핵심연구지원센터(CFICDD)의 기술적 지원으로 수행되었음.

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