홉 추출물 성분프로파일 및 지표물질 분리

홉(Humulus lupulus)은 삼과(Cannabaceae)에 속하는 유럽 및 북미 원산의 덩굴성 초본 다년생식물으로 암꽃을 주로 의약적, 산업적 용도로 이용되고 있다. 특히, 양조산업에서 맥주의 쓴맛과 향을 더하는데 사용된다.^1,2) 홉의 성분으로는 prenylflavonoid 계열인 xanthohumol을 비롯하여 isoxanthohumol, 8-prenylnarigenin, 6-prenylnaringenin, humulone (α-acid), lupulone (β-acid), isoquercitrin 등이 있다.^2,3) Xanthohumol은 홉의 주성분으로 관련 prenylchalcone는 항암효과가 있다고 알려져 있으며, 이외의 flavonoids는 항산화, 대사장애 조절, 진정작용, 항염증과 같은 활성효과가 있고 알려져 있다.^2,3)

MS 기기의 발전으로 데이터 처리속도, 민감도, 분해능이 증가하면서 생성되는 데이터의 양과 복잡성이 늘어남에 따라서 복잡한 데이터를 처리하기 위해 LC-MS같은 프로파일링 과정이 대사체학 연구에서 적용된다.^4,5) 분자 네트워킹(molecular networking)은 비표적 질량분석(MS) 데이터를 시각화하여 주석(annotate)하는 생물정보학 핵심 기법이다.⁴⁾ MZmine은 2005년부터 개발된 프로그램으로 LC-MS, GC-MS, IMS-MS 및 MS 데이터를 통합하여 분석할 수 있으며 대사체학 연구에 활용된다.^4,5) MZmine은 측정된 질량분석 데이터의 시간(RT), 질량(m/z), 이온 이동도(ion mobility)를 정렬하고 “Recursive threshold” 알고리즘을 통해 noise로 분류되는 peak를 제거하여 신뢰성을 높인다.^3,4) MZmine을 통해서 처리된 데이터는 SIRIUS, MetaboAnalyst, GNPS 등 다른 분석 플랫폼과 연계되어 사용된다.⁴⁾ Global Natural Products Social Molecular Networking (GNPS)는 데이터를 시각화 하기 위해 사용되는 플랫폼으로 MS2 (tandem 질량 분석)데이터를 활용하여 스펙트럼 유사도에 따라 관련 분자를 연결한다.⁵⁾ GNPS 플랫폼은 질량 분석 기반 대사체학 연구에 활용되며 GNPS내의 다양한 workflow를 통해 분자네트워킹에 사용된다.⁵⁾

홉은 여러 효능가치가 보고된 식물로 미래에 생물학적 응용이 가능할 것으로 보여지는 식물로 연구가치가 충분하다고 판단된다. 본 연구에서는 고성능액체크로마토그래피(HPLC)와 질량분석법(MS)을 통해 얻은 질량분석 데이터로 분자네트워크 접근법을 이용하여 홉에 다양하게 분포 되어있는 미량성분들을 분석하였다. 분자네트워크 접근법을 활용하여 3종의 chalcone과 1종의 flavonol을 분리하고 구조를 동정하였다.

재료 및 방법

실험 재료 -실험에 사용한 홉 추출물(49 g)은 (주)뉴트리케어를 통해 50% 주정 EtOH로 추출된 분말 형태로 제공받았다.

기기 및 시약 –분석용 고성능 액체크로마토그래피(Ultra-High performance liquid chromatography, UHPLC)는 Thermo사의 UHPLC pump, UHPLC detector가 장착된 Vanquish Flex-A10 UHPLC를 사용하였다. 고분해능 질량분석장비는 Thermo사의 Orbitrap Exploris 120을 사용하였고, UHPLC-MS column (Hypersil GOLD^TM aQ, 5 µm, 100*2.1 mm)을 사용하였다. TLC 분석은 Merck사의 TLC-silica gel: 60 F₂₅₄ and RP-18 F₂₅₄ plates를 사용하였다. 중압액체크로마토그래피(MPLC)는 CombiFlash®PF+ (Teledyne Isco, USA)와 RediSep®사의 NP silica gel, NP column을 사용하였다. 분취용 HPLC는 PDA detector를 구비된 Waters사(Milford, MA, USA)의 996을 사용하였으며,

분취용 컬럼은 YMC사의 actus Triart C18 (250*20 mm I.D.S-5 µm, 12 nm; Seongnam-si, Gyeonggi-do, Republic of Korea)을 사용하였다. ¹H-NMR (500 MHz)과 ¹³C-NMR spectra (125 MHz)는 강원대학교 항암혁신신약개발 핵심연구지원센터에 설치된 JEOL JNM-ECZR 500Mhz 기기를 사용하였다. Sephadex는 LH-20 (18-111 um, GE Healthcare, Sweden)를 사용하였다. HPLC용매는 MeOH, MeOH, can (Honeywell, Charlotte, North Carolina, USA)을 사용하였다. 기타 유기용매는 1-utanol (삼전순약공업(주), Seoul, Korea), DCM (삼전순약공업(주), Seoul, Korea), n-exane (삼전순약공업(주), Seoul, Korea)을 사용하였다. NMR 측정 용매는 Cambridge Isotope Laboratories (Tewksbury, MA, USA)의 methanol-d₄ (CD₃OD), dimethyl sulfoxide-d₆ (DMSO-d₆)을 사용하였다.

추출 및 분리 –뉴트리케어로부터 50% 주정EtOH로 추출된 홉 49 g을 받아 진행하였다. 농축되어 있는 추출물을 증류수로 현탁하여 n-hexane, EtOAc, n-BuOH로 순차적으로 분획한 뒤 감압 농축하여 각각 1.86, 8.68, 6.58 g을 획득하였다. EtOAc 분획물 (8.68 g)을 순상 컬럼인 RediSep® NP silica gel에 n-Hex-EtOAc=7:3, 6:4, 5:5, 4:6, 3:7과 DCM-MeOH=9:1, 8:2, 7:3을 용매로 순차적으로 중압액체크로마토그래피를 진행하였고, TLC분석을 실시, 18개의 하위 분획물(HLE-1 ~ 18)로 나누었으며, 화합물 4 (255.1 mg)를 얻었다. HLE-5 분획물을 Sephadex LH-20을 고정상으로 하고 MeOH를 이동상으로 한 open column chromatography를 실시하여 용출시켜 12개의 소분획과 화합물 1 (50.4 mg)을 얻었다(HLE5-1~HLE5-12). HLE5-9를 분취용 HPLC를 이용해 [MeOH:H₂O (8:2), 5mL/min]조건으로 이동상을 용출시켜 화합물 2 (1.6 mg) 및 3 (1.9 mg)을 얻었다.

분자 네트워크법 홉 추출물의 하위 분획물(HLE5-9, HLE16)의 raw 데이터를 mzmine 소프트웨어(version. 3.9.0 august 22 2023)을 사용하였으며, noise를 제거하기 위해 ms detection ms noise level MS1과 MS2은 각각 MS 1: 1.0 E5 MS 2: 6.0 E3으로 설정하였으며, parameter setting은 ADAP chromatogram builder를 사용하였으며, min height intensity: 1.0 E6, m/z tolerance: 0.0030 m/z or 5.0 ppm으로 설정하여 mgf file로 변환 후 GNPS (https://gnps2.org/homepage)의 분자네트워크 웹사이트를 통해 처리하였다. workspace는 feature-based molecular networking (FBMN)을 사용하였다. precursor ion tolerance 및 fragment ion mass tolerance는 0.02 Da 로 설정하였으며, minimum cosine score 0.7, min matched peaks 6개이다. MS스펙트럼 데이터는 GNPS 스펙트럼 라이브러리에서 검색되었으며, MN결과를 시각화하기 위해 cytoscape (version. 3.10.2)를 사용하여 진행하였다.

Xanthohumol (1) – yellow powder; ¹H NMR (500 MHz, DMSO-d₆) δ 14.62 (s, 1H), 7.74 (d, J=15.5 Hz, 1H, H-α), 7.65 (d, J=15.6 Hz, 1H, H-β), 7.55 (d, J=8.6 Hz, 2H, H-2,6), 6.82 (d, J=8.6 Hz, 2H, H-3,5), 6.05 (s, 1H, H-5'), 5.12 (m, 1H, H-1''), 3.84 (s, 3H, 6'-OCH₃), 3.12 (d, J=7.1 Hz, 2H, H-2''), 1.68 (s, 3H, H-5''), 1.59 (s, 3H, H-4''); ¹³C NMR (125 MHz, DMSO-d₆) δ 191.6 (ketone), 164.63 (C-2'), 160.55 (C-6'), 159.93 (C-4), 142.5 (C-β), 130.5 (C-2,6), 129.9 (C-3''), 126.1 (C-1), 123.8 (C-α), 123.1 (C-2''), 116.0 (C-3,5), 107.4 (C-3'), 104.5 (C-1'), 91.05 (C-5'), 55.8 (C-6'-OCH₃), 25.5 (C-4''), 21.1 (C-1''), 17.7 (C-5''); ESI-MS m/z 355.1538 [M+H]⁺.

Xanthohumol D (2) – Pale yellow powder; ¹H NMR (500 MHz, methanol-d₄): δ 7.82 (d, J=15.5 Hz, 1H, H-α), 7.70 (d, J=15.5 Hz, 1H, H-β), 7.53 (d, J=8.5 Hz, 2H, H-2,6), 6.85 (d, J=8.6 Hz, 2H, H-3,5), 6.06 (s, 1H, H-5'), 4.83 (m, 1H, H-1''a), 4.73 (m, 1H, H-1''b), 4.36 (m, 1H, H--2''), 3.93 (s, 3H, 6'-OCH₃), 2.98 (dd, J=13.8, 5.5 Hz, 1H, H-4''a), 2.81 (dd, J=13.8, 7.4 Hz, 1H, H-4''b), 1.83 (s, 3H, H-5''); ¹³C NMR (125 MHz, methanol-d₄): δ 194.1 (ketone), 166.6 (C-6'), 165.2 (C-4'), 162.9 (C-2'), 161.1 (C-4), 148.9 (C-3''), 143.5 (C-β), 131.3 (C-2,6), 128.5 (C-α), 125.8(C-1), 116.9 (C-3,5), 110.8 (C-4''), 106.8 (C-5'), 106.2 (C-1'), 92.2 (C-3'), 76.8 (C-2''), 56.2 (C-6'-OCH₃), 29.8 (C-1''), 17.9 (C-5''); ESI-MS m/z 371.1487 [M+H]⁺.

Xanthohumol B (3) – Pale yellow powder; ¹H NMR (500 MHz, methanol-d₄) δ 7.84 (d, J=15.5 Hz, 1H, H-α), 7.73 (d, J=15.6 Hz, 1H, H-β), 7.53 (d, J=8.5 Hz, 2H, H-2,6), 6.85 (d, J=8.6 Hz, 2H, H-3,5), 6.02 (s, 1H, H-5'), 3.93 (s, 3H, 6'-OCH₃), 3.79 (dd, J= 6.9, 5.3 Hz, 1H, H-2''), 2.87 (dd, J=16.7, 5.3 Hz, 1H, H-1''a), 2.55 (dd, J=16.7, 6.9 Hz, 1H, H-1''b), 1.37 (s, 3H, H-4''), 1.32 (s, 3H, H-5''); ¹³C NMR (125 MHz, methanol-d₄) δ 194.2 (ketone), 166.3 (C-2'), 162.5 (C-6'), 161.3 (C-4'), 143.9 (C-β), 131.4 (C-2,6), 128.4 (C-1), 125.5 (C-α), 116.9 (C-3,5), 106.7 (C-3'), 101.9 (C-1'), 92.9 (C-5'), 79.71 (C-3''), 69.9 (C-2''), 56.3 (C-6'-OCH₃), 26.2 (C-1''), 25.7 (C-4''), 21.4 (C-5''); ESI-MS m/z 371.1490 [M+H]⁺.

Isoquercitrin (4) – Dark yellow powder; ¹H-NMR (500 MHz, methanol-d₄) δ 7.73 (d, J=2.2 Hz, 1H, H-2'), 7.62 (dd, J=8.5, 2.2 Hz, 1H, H-6'), 6.90 (d, J=8.5 Hz, 1H, H-5'), 6.43 (d, J=2.1 Hz, 1H, H-8), 6.24 (d, J=2.1 Hz, 1H, H-6), 5.28 (d, J=7.6 Hz, 1H, H-1''), 3.74 (dd, J=11.9, 2.4 Hz, 1H, H-6''a), 3.60 (dd, J=11.9, 5.4 Hz, 1H, H-6''b), 3.51 (dd, J=9.1, 7.6 Hz, 1H, H-3''), 3.45 (t, J=8.9 Hz, 1H, H-2''), 3.37 (m, 1H, H-4''), 3.24 (m, J=9.6, 5.4, 2.4 Hz, 1H, H-5''); ¹³C NMR (125 MHz, methanol-d₄) δ 179.5 (C-4), 166.1 (C-7), 163.1 (C-5), 159.0 (C-2), 158.5 (C-9), 149.9 (C-4'), 145.9 (C-5'), 135.6 (C-3), 123.2 (C-5'), 123.1 (C-1'), 105.7 (C-10), 104.3 (C-1''), 99.9 (C-6), 94.7 (C-8), 78.4 (C-5''), 78.1 (C-3''), 75.7 (C-2''), 71.2 (C-4''), 62.6 (C-6''); ESI-MS m/z 487.0848 [M+Na]⁺.

결과 및 고찰

화합물 1의 HRESI-MS 스펙트럼에서 m/z 355.1538 [M+H]⁺를 통해 분자식은 C₂₁H₂₂O₅임을 유추할 수 있었다. 화합물 1은 분자 네트워크법을 이용하여 MS/MS pattern을 GNPS library와 비교하고 참고문헌을 비교해 chalcone 구조이며, xanthohumol임을 유추하였다(Fig. 1 and 2).⁷⁾ 1의 ¹H NMR 스펙트럼의 δ_H 7.56 (2H, d, J=8.6 Hz, H-2,3), 6.83 (2H, d, J=8.6 Hz, H-5,6)에서 나타나는 doublet이 벤젠고리의 4-치환체를 유추하였으며, δ_H 7.75 (1H, d, J=15.5 Hz, H-α), 7.65 (1H, d, J=15.5 Hz, H-β) 신호로 trans 형태의 이중결합을 갖고 있음을 확인하였고, δ_H 3.85 (3H, s, 6'-OCH₃)으로 벤젠고리에 메틸기가 있음을 확인하였고, ¹³C NMR의 결과로 케톤기(δ_C 191.6)를 갖고 있음을 확인하여, 이상의 결과로 화합물 1은 chalcone구조임을 유추하였다. ¹H-NMR에서 singlet 형태의 δ_H 1.68 (s, 3H, H-5''), 1.59 (s, 3H, H-4'')으로 2개의 메틸기와 δ_H 3.12 (d, J=7.1 Hz, 2H, H-2'')과 5.12 (m, 1H, H-1'')의 coupling constant는 각각 doublet, multiplet을 확인하여 prenyl기가 있음을 유추하였고, 이러한 결과로 화합물 1의 구조를 분석자료를 참고문헌과 비교하여 xanthohumol로 동정하였다(Fig. 2).⁸⁾

Fig. 1

Molecular network of the total extract from H. lupulus. Node colors indicate the following: purple (1), red (2), orange (3), and green (4), corresponding to compounds 1–4, respectively.

Fig. 2

Chemical structures of the compounds 1-4.

화합물 2는 HRESI-MS 스펙트럼에서 m/z 371.1487 [M+H]⁺를 통해 C₂₁H₂₂O₆로 보아 화합물 1에 알코올기가 추가된 것을 유추할 수 있었다. 화합물 2는 분자네트워크법을 통해 1과 같은 cluster에 있으며, MS/MS pattern을 참고문헌과 비교하여 1의 유도체임을 유추하였다(Fig. 1).⁹⁾ 화합물 2의 ¹H-NMR 스펙트럼 δ_H 4.83 (H, m, J=1.05 Hz, H-1''a), 4.73 (H, m, J=1.05 Hz, H-1''b)의 신호로 2'' 위치에 1과 달리 치환체를 갖고 있음을 알 수 있었고, ¹³C-NMR을 통해 치환체로 알코올기가 결합되어 있음을 알 수 있었다. δ_H 1.83 (s, 3H, H-5'')하나의 메틸기와 δ_H 2.98 (H, dd, 13.8, J=5.5 Hz, H-4''), 2.81 (H, dd, J=13.8, 7.4 Hz, H-4'')의 신호로 geminal 형태의 이중결합을 이루고 있음을 유추하였고, HMBC를 통해 H-5''이 C-2'',3'',4''에 correlation peak (δ_H 1.83/δ_C 76.8, 148.9, 110.8) 함을 통해 C-3''위치에 메틸기가 있음으로 2''위치에 알코올기가 있는 isoprenyl기임을 유추하였다. 이러한 결과로 화합물 2의 구조를 분석자료를 참고문헌과 비교하여 xanthohumol D로 동정하였다(Fig. 2)⁸⁾

화합물 3는 HRESI-MS 스펙트럼에서 m/z 371.1487 [M+H]⁺를 통해 C₂₁H₂₂O₆으로 2의 유도체로 예상하였다. 화합물 3은 2와 달리 다른 클러스터에 있으나, 분자 네트워크법으로 MS/MS pattern을 참고문헌과 비교하여 2의 유도체임을 유추하였다(Fig. 1).¹⁰⁾ δ_H 2.87 (H, dd, J=16.75, 5.33 Hz, H-1''a), 2.55 (H, dd, J=16.74, 6.94 Hz, H-1''b)으로 2''이 치환체를 갖고 있음을 유추하였다. ¹³C-NMR δ_C 69.9 (C-2'')신호로 2''위치에 알코올기가 연결되어 있고, δ_C 79.7 (C-3'')신호로 exomethylene 구조를 가진 화합물 2와 달리 chromane 골격을 유추하였다. 또한 2개의 메틸기 신호 [δ_H 1.37 (s, 3H, H-4''), 1.32 (s, 3H, H-5'')]를 확인하였고, HMBC 스펙트럼을 통해 H-4'', H-5''과 C-3''의 correlation (δ_H 1.37, 1.32/δ_C 75.1, 79.7)을 확인하여 두 개의 메틸기가 모두 3'' 위치에 결합된 것을 확인하였다. 이러한 결과로 화합물 3을 참고문헌과 비교한 결과 xanthohumol B로 동정하였다(Fig. 2).⁸⁾

화합물 4는 분리과정 중에 추가로 분리된 화합물로서, NMR 정보를 통해 chalchone 유도체가 아님을 확인하였다.¹¹⁾ 화합물 4의 HRESI-MS 스펙트럼에서 m/z 465.1026 [M+H]⁺를 통해 분자식은 C₂₁H₂₁O₁₂ 임을 유추하였다. 분자네트워크법을 통해 flavonoids 유도체 중 isoquercitrin을 추측하였고, 참고문헌과 비교하여 그 값과 ¹H와 ¹³C-NMR 스펙트럼을 통해 isoquercitrin으로 동정하였다(Fig. 2).¹²⁾ 또한 분리한 화합물을 표준품으로 이용하여, 검출시간과 MS/MS 데이터를 비교하여 분자네트워크 내에서 해당 물질의 노드를 확인할 수 있었으며, chalcone 유도체와는 다른 cluster에 존재하고 있음을 확인하였다(Fig. 1)

결 론

홉의 주정 EtOH 추출물로 분리한 chalcone 3종과 flavonoid 1종을 분리하였다. 분자네트워크법을 통해 형성된 cluster를 이용하여 xanthohumol (1) xanthohumol D (2), xanthohumol B (3) 및 isoquercitrin (4)을 분리하고, 분광학 분석을 통해 동정하였다.

Acknowledgments

본 연구는 농촌진흥청의 농업과학기술 공동연구사업(과제번호: RS-2022-RD010295)에 의해 수행한 결과이며, 또한 핵자기공명분광기 사용은 강원대학교 항암혁신신약개발 핵심연구지원센터(CFICDD)의 기술적 지원으로 수행되었으며, 지원에 감사드립니다.

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