Pseudocyphellaria freycinetii의 메탄올 추출물로부터 분리된 이차대사산물들 및 이들의 세포독성 효과

지의류는 곰팡이와 같은 균류와 녹조류와 같은 조류가 서로 영양분 및 광합성 에너지들을 교환하며 공생관계를 맺고 살아가는 복합 생명체이다.¹⁾ 지의류는 해발 6,000 m 이상의 고산, 사막, 적도에서 남.북극 지역까지 모든 환경에 서식하고 있으며 일반 생물들이 살기 어려운 화산 분화 지역 등을 포함한 전 세계 지역에 분포하고 있다.²⁾ 지의류로부터 depsidone 류, dibenzofuran 류, anthraquinone 류 그리고 xanthone 류 등과 같은 다양한 화학성분들이 분리되었으며, 이러한 화합물들은 항생, 항염증, 항산화 및 항암 등의 다양한 생리활성들이 보고되고 있다.^3,4)

Pseudocyphellaria (Lobariaceae)는 주로 남쪽의 온대 및 아 남극 지역에 널리 분포되어 있으며 약 170여종을 포함하고 있다.⁵⁾ P. anthraspis, P. crocata 및 P. berberina들로부터 pulvinic acid 유도체 화합물^6,7) P. divulsa, P. exanthematica, P. meyenii 그리고 P. nitide 종들로 부터 zeorin을 포함한 hopane triterpenoid, ergosterol peroxide, tenuiorin, constictic acid, cryptostictic acid, norstictic acid, hyposalazinic acid, stictic acid, leucotylin 등의 화합물들이 보고되었고,⁷⁾ P. endochrysa 종에서는 calycin과 pulvinic dilactone이 분리되었다.⁸⁾ 이들 화합물 중 일부 hopane-type triterpenoid는 기생충 억제 작용 및 항암 등의 활성이 있는 것으로 보고되었다.^9,10) 우리의 이전 연구에서는 P. freycinetii로부터 분리된 7β,22-dihydroxyhopane 화합물의 교모 세포 종 줄기세포(Glioma Stem Cells)에 대한 억제 작용을 보고하였다.¹¹⁾

남극 및 아 남극권의 지의류들을 이용한 계속적인 항암제 후보물질 개발 연구 중 P. freycinetii의 메탄올(MeOH) 추출물이 Hela cell (자궁경부암세포)에 대하여 암 세포의 성장을 억제하는 것으로 나타났다. 본 연구에서 P. freycinetii의 메탄올 추출물에 대한 이화학적 연구를 통하여 이미 보고된 7β,22-dihydroxyhopane과 함께 1 종의 hopane-type triterpenoid 유도체 및 2종의 phenol성 화합물들에 대한 물리화학적 분석 자료를 통한 구조 동정 및 분리된 물질들의 여러 암세포들에 대한 억제 활성을 보고한다.

재료 및 방법

실험재료 – 연구에 사용된 지의류는 2017년 1월 칠레의 푼타아레나스에서 채집되었다. 시료는(AL-100) 극지연구소 김지희 박사가 P. freycinetii로 동정을 하였고, 극지연구소 천연물 화학 연구실에 보존되었다.

세포독성의 측정 – P. freycinetii의 메탄올 추출물을 DMSO에 용해 한 후 DMEM 배지 또는 RPMI 1640 배지에 6.25, 12.5, 25 그리고 50 µM의 농도로 처리하였다. Hela, B-16 melanoma, LLC cell (2×10⁴ cells/well)를 96-well plate에 배양하였고, 이 후 P. freycinetii로부터 분리된 화합물들을 48시간 동안 50 µM 부터 6.25 µM농도까지 처리하였다. 배양액에 MTT를 처리하고 37°C에서 인큐베이션 하였다. 처리된 세포를 50% DMSO 와 20% SDS을 플레이트에 넣고 마이크로 플레이트 리더를 사용하여 570 nm에서 흡광도를 측정하였다. 생존 세포의 백분율을 다음 공식을 사용하여 계산하였다. 백분율 세포 생존력 = [광학 실험 샘플의 밀도(OD)/대조군의(OD)] × 100을 사용하여 백분율(%)을 계산하였다(Fig. 3).

시약 및 기기 – 1D 및 2D NMR은 Bruker AVANCE (600MHz) spectrometer를사용하였다. Mass spectra는 BioTOF II ESI mass spectrometer를 이용 하였다. TLC는 Merck precoated silica gel F254 plates를 사용 하였으며, 역상 TLC로는 RP-C18 F254s plates가 이용되었다. UV light를 이용하여 254 nm와 365 nm에서 1차적으로 확인하고, 10% sulfuric acid를 이용하여 발색을 확인하였다. Column chromatography에 이용한 충진제는 silica gel 60 (230-400 mesh, Merck, Germany), RP-C18 silica gel (YMC GEL ODS-A, 12 nm, S-75 μm, Japan)과 Sephadex LH-20 (Pharmacia Co. Japan)가 이용되었다. Semi-preparative HPLC는 YL9100 HPLC system (Young Lin, South Korea)을 이용하였고, column으로는 Alltech reversed-phase YMC-PakC-18 column (10 μm, 20 × 250 mm, Japan)을 사용하였다.

추출 및 분리 – 상온에서 음건한 P. freycinetii 100 g을 상온(25°C)에서 methanol (MeOH)을 1 L를 사용하여 1일, 3회 반복하여 저온 침출법으로 추출하였고, 감압농축기를 사용하여 15.2 g의 메탄올 추출물을 얻었다. 얻어진 추출물은 증류수(H₂O, 1L)로 희석하였고 극성에 따라 hexane (Hex), ethyl acetate (EtOAc), butanol (BuOH) 순으로 각 1 L, 3회씩 순차적으로 분획하여 Hex (1.5 g), EtOAc (2.9 g), BuOH (3.1 g) 및 H₂O 분획물(3.7 g)을 얻었다. 얻어진 분획물들 중 TLC 분석을 통하여 Hex 분획물에서 주요 화합물들이 포함된 것을 확인하였으며, Hex 분획물에 대하여 우선적으로 분리를 시도하였다. Hex 분획물(1.5 g)은 silica gel column을 사용하여 CHCl₃:MeOH (99:1‒9:1)의 이동상 용매 조건으로 분리를 실시하였고, 총 12개의 분획물들을 얻었다(HS. 1‒HS. 12). 분획물들 중 HS. 6 (309 mg)을 다시 Sephadex-LH-20 gel column과 이동상 용매로 MeOH:H₂O (70:30)를 이용하여 5개의 소분획(HS. 6.1‒HS. 6.5)들을 얻었으며, 그 중 분획물 HS. 6.4 (81 mg)을 semi-preparative HPLC와 60%MeOH의 이동상 용매를 사용하여 화합물 3 (5 mg)을 얻었다. 분석용 TLC에서 황산 발색 법에 의하여 두개의 주요 화합물이 관측된 분획물 HS. 8 (950 mg)을 silica gel column을 사용하여 Hex:EtOAc (9:1-7:3)의 이동상 용매로 분리를 실시하였다. 이로부터 하얀색의 무형 고체들이 관찰된 소분획물 HS. 8.2와 HS 8.4를 얻었으며, hexane:EtOAc (1:1)용매를 이용한 재결정법으로 화합물 1 (143 mg)과 2 (383 mg)를 각각 얻었다. 분획물 HS. 9 (40 mg)에 대하여 H₂O:MeOH (50:50)의 용매 조건에서 Sepadex LH-20 gel column을 사용하여 5개의 소분획물(HS. 9.1‒HS. 9.5)들을 얻었고, 이들 중 HS. 9.3번은 semi-preparative HPLC (85% MeOH)를 사용하여 화합물 4 (5 mg)를 얻었다.

7β,22-Dihydroxyhopane (1) – 무형의 하얀색 고체; $$ {\left[\mathrm{\alpha }\right]}_{\mathrm{D}}^{20}$$+25.2° (c 0.2, CHCl₃); ¹H-NMR (600 MHz, CDCl₃): δ 3.88 (1H, m, H-7), 2.22 (1H, m, H-21), 2.23 (1H, m, H-6b), 1.78 (1H, m, H-20a), 1.71 (1H, m, H-15a), 1.65 (1H, m, H-1a), 1.65 (1H, m, H-3a), 1.63 (1H, m, H-6a), 1.55 (1H, m, H-5b), 1.54 (1H, m, H-16b), 1.52 (1H, m, H-11b), 1.52 (1H, m, H-20b), 1.51 (1H, m, H-2b), 1.51 (1H, m, H-3a), 1.51 (1H, m, H-15a), 1.46 (1H, s, H-17), 1.45 (1H, m, H-12a), 1.37 (1H, m, H-2a), 1.34 (1H, m, H-11a), 1.34 (1H, m, H-19b), 1.30 (1H, s, H-13), 1.29 (1H, m, H-16a), 1.21 (3H, s, CH₃-30), 1.18 (3H, s, CH₃-29), 1.13 (1H, m, H-19a), 1.05 (3H, s, CH₃-27), 1.00 (3H, s, CH₃-26), 0.84 (3H, s, CH₃-23), 0.82 (3H, s, CH₃-28), 0.79 (3H, s, CH₃-24), 0.76 (3H, s, CH₃-25), 0.72 (1H, H-1a), 0.72 (1H, s, H-5); ¹³C-NMR (150 MHz, CDCl₃): δ 74.8 (C-7), 73.7 (C-22), 55.7 (C-5), 50.5 (C-9), 50.4 (C-21), 50.3 (C-17), 48.1 (C-13), 47.1 (C-8), 44.2 (C-18), 43.5 (C-14), 41.9 (C-19), 40.9 (C-3), 40.4 (C-1), 37.5 (C-10), 36.8 (C-15), 33.2 (C-23), 33.2 (C-4), 32.5 (C-6), 30.9 (C-30), 28.7 (C-29), 26.9 (C-20), 24.1 (C-12), 21.6 (C-24), 20.8 (C-16), 18.9 (C-11), 18.7 (C-2), 17.4 (C-27), 15.8 (C-28), 15.7 (C-25), 11.7 (C-26); (+)ESI-MS: m/z 445 [M+H]⁺.

7β-Acetoxy-22-hydroxyhopane (2) – 무형의 하얀색 고체; $$ {\left[\mathrm{\alpha }\right]}_{\mathrm{D}}^{20}$$ + 23.5° (c 0.2, CHCl₃); ¹H-NMR (600 MHz, CDCl₃): δ 5.64 (1H, s, H-7), 2.22 (1H, s, H-21), 1.96 (3H, s, OCOCH₃), 1.89 (1H, m, H-16b), 1.75 (1H, m, H-20b), 1.74 (1H, m, H-6b), 1.64 (1H, m, H-2b), 1.58 (1H, m, H-11b), 1.58 (1H, m, H-15b), 1.56 (1H, m, H-2b), 1.56 (1H, m, H-15a), 1.56 (1H, m, H-16b), 1.54 (1H, m, H-19b), 1.49 (1H, m, H-20a), 1.46 (1H, s, H-5), 1.44 (1H, s, H-17), 1.41 (1H, m, H-11a), 1.41 (2H, m, H-12), 1.39 (1H, m, H-2a), 1.39 (1H, m, H-6a), 1.38 (1H, s, H-9), 1.37 (1H, m, H-3b), 1.25 (1H, s, H-13), 1.20 (3H, s, CH₃-30), 1.17 (3H, s, CH₃-29), 1.12 (1H, m, H-3a), 1.08 (3H, s, CH₃-26), 1.03 (3H, s, CH₃-27), 0.94 (1H, m, H-19a), 0.86 (3H, s, CH₃-23), 0.82 (3H, s, CH₃-28), 0.75 (1H, m, H-1a), 0.75 (3H, s, CH₃-25); ¹³C-NMR (150 MHz, CDCl₃): δ 170.5 (OCOCH₃), 75.9 (C-7), 73.9 (C-22), 53.3 (C-17), 52.7 (C-5), 51.5 (C-21), 50.5 (C-13), 49.9 (C-9), 46.4 (C-8), 44.1 (C-18), 43.2 (C-14), 41.7 (C-3), 41.5 (C-19), 40.1 (C-1), 37.3 (C-10), 36.6 (C-15), 33.1 (C-4), 33.0 (C-23), 30.9 (C-30), 28.8 (C-29), 25.5 (C-20), 25.7 (C-6), 23.9 (C-12), 22.3 (C-16), 21.9 (OCOCH₃), 21.5 (C-24), 20.4 (C-11), 18.6 (C-2), 17.8 (C-27), 16.0 (C-28), 15.5 (C-25), 12.5 (C-26); (+)ESI-MS: m/z 487 [M+H]⁺.

3,6-Dimethyl-4-hydroxy-2-methoxybenzaldehyde (3) − 무형의 하얀색 고체; ¹H-NMR (600 MHz, CD₃OD): δ 10.5 (1-CHO), 6.99 (1H, s, H-5), 3.97 (3H, s, 2-OCH₃), 2.55 (3H, s, 6-CH₃), 2.16 (3H, s, 3-CH₃); ¹³C-NMR (150 MHz, CD₃OD): δ 188.1 (C-7), 166.0 (C-4), 163.1 (C-2), 147.8 (C-6), 122.6 (C-1), 114.0 (C-3), 111.8 (C-5), 54.9 (2-OCH₃), 20.7 (6-CH₃), 8.5 (3-CH₃); (+)ESI-MS: m/z 182 [M+H]⁺.

2,4-Dihydroxy-6-methylbenzoate (4) − 무형의 하얀색 고체; ¹H NMR (600 MHz, CD₃OD): δ 6.18 (1H, d, J=2.4 Hz, H-5), 6.13 (1H, d, J=2.4 Hz, H-3), 3.89 (3H, s, 7-OCH₃), 2.44 (3H, s, 6-CH₃); ¹³C-NMR (150 MHz, CD₃OD): δ 173.5 (C-7), 166.3 (C-2), 164.5 (C-4), 144.5 (C-6), 112.8 (C-5), 105.6 (C-1), 101.9 (C-3), 52.1 (7-OCH₃), 24.4 (6-CH₃); (+)ESI-MS: m/z 180 [M+H]⁺.

결과 및 고찰

P. freycinetii의 메탄올 추출물로부터 얻은 Hex 분획물에 대하여 open column chromatography로 분리한 후 semi-preparative HPLC를 실시하여 기존 보고된 화합물 1번 외에 3 종의 화합물들을 분리하였다(Fig. 1).

Fig. 1.

Chemical structures of compounds 1−4.

화합물 1은 ESI-MS 분석에서 m/z 445[M+H]⁺의 molecular ion 관측을 통하여 분자량 444를 유추할 수 있었다. 이 화합물의 ¹H-NMR spectrum 분석한 결과 hopane-type triterpenoid (C₃₀-triterpenoid) 구조에서 보여지는 8개의 특징적인 singlet methyl기 [δ_H 1.18 (H-29), 1.21 H-30), 1.05 (H-27), 1.00 (H-26), 0.84 (H-23), 0.82 (H-28), 0.79 (H-24), 0.76 (H-25)]들과 δ_H 3.84 (H-7)에서 oxygenated methine proton을 확인하였다. ¹³C- 및 DEPT135 NMR, HSQC 분석을 통하여 δ_C 73.7 (C-22)에서 하나의 oxygenate quaternary carbon과 δ_C 74.8 (C-7)에서 1개의 oxygenated methine carbon들을 관측하였다. 또한, δ_C 33.2 (C-23), δ_C 21.6 (C-24), δ_C 15.7 (C-25), δ_C 11.7 (C-26), δ_C 17.4 (C-27), δ_C 15.8 (C-28), δ_C 28.7 (C-29), δ_C 30.9 (C-30)에서 8개의 methyl carbon들을 포함하여 총 30개의 탄소를 관측하였다. 이로부터 화합물 1은 hopane-type triterpenoid 화합물로 확인되었으며, zeorin의 구조와 매우 유사하였다.^7) 1H-¹³C HMBC 실험에서 H-7 (δ_H 3.84)와 C-26 (δ_C 11.7)/C-14 (δ_C 43.5)들과의 상관관계를 확인 함으로써 OH group이 7번 위치의 탄소에 치환되어 있음을 확인하였다. 추가적으로 H-29 (δ_H 1.18)과 H-30 (δ_H 1.21)의 methyl proton들은 δ_C 50.4 (C-21)/73.7 (C-22)들과의 HMBC correlation을 확인함으로서 나머지 OH group이 치환된 2-hydroxypropyl group은 C-21번에 연결되어 있음을 확인하였다(Fig. 2). 화합물 1의 optical rotation 값($$ {\left[\mathrm{\alpha }\right]}_{\mathrm{D}}^{20}$$+ 25.2°)은 문헌 값($$ {\left[\mathrm{\alpha }\right]}_{\mathrm{D}}^{20}$$ + 26.3°)과 비교하여 매우 유사함을 나타내었으며,¹²⁾ 이로부터 7번 탄소에서 OH group은 β-form으로 결정되었다. 화합물 1은 1D와 2D NMR 분석 값 과 문헌 값과의 비교를 통하여 7β,22-dihydroxyhopane의 구조로 확인하였다.

Fig. 2.

Key 1H-13C HMBC correlations of compounds 1 and 2.

화합물 2의 ¹H-NMR 및 ¹³C-NMR 분석에서 화합물 1의 chemical shift들과 유사한 패턴을 보였다. 그러나, 화합물 1에서의 methine proton (δ_H 3.84, H-7)은 화합물 2에서는 δ_H 5.07까지 저자장 영역으로 이동한 것을 관측하였고, δ_H 1.96 (OCOCH₃)에서 acetyl group에 치환된 methyl group proton의 특징적인 signal을 하나 더 나타내었다. ¹³C-NMR spectrum에서는 하나의 ester carbonyl carbon (δ_C 170.5)이 관측 되었으며, HMBC 분석을 통해 δ_H 5.07 (H-7)/δ_H 1.96 (-CH₃)와 δ_C 170.5 (OCOCH₃)에서의 carbonyl carbon과 상관관계를 확인함으로써 화합물 2은 화합물 1의 C-7번 위치에서 OH group 대신 acetyl group이 치환되어 있음을 확인 하였다(Fig. 3). 따라서, δ_H 5.07에서 관측된 methine proton은 acetyl group의 deshielding effect로 인하여 OH group이 치환되어 있을 때 보다 더 저자장 영역으로 이동된 것으로 보인다. 화합물 2의 optical rotation 값은($$ {\left[\mathrm{\alpha }\right]}_{\mathrm{D}}^{20}$$ + 23.5°) 화합물 1의 값과 유사함을 나타내었으며, C-7에서의 acetyl group 또한 β-form으로 결정되었다. 따라서, 화합물 2번은 화합물 1과의 NMR data 비교, 2D-NMR 분석 및 문헌 값과의 비교에 의하여 7β-acetoxy-22-hydroxyhopane으로 동정하였다.¹³⁾

Fig. 3.

Cytotoxicity of compound 1 on Hela cell.

화합물 3의 ¹H-NMR spectrum 분석은 δ_H 6.99 영역에서 하나의 aromatic proton이 관측되었다. 고자장 영역에서 δ_H 2.16 (3H, s, H-3) 과 δ_H 2.55 (3H, s, H-6)의 관측은 2개의 methyl기의 존재를 유추하였고, δ_H 10.53 (H-1) 영역에서 하나의 aldehyde proton과 δ_H 3.97 (2-OCH₃)의 영역에서 하나의 methoxy proton signal을 확인하였다. 화합물 3의 HSQC spectrum을 통해 ¹H- 및 ¹³C-NMR 값들을 확인 하였다. 따라서, 화합물 3은 NMR 데이터 와 문헌 값을 비교하여 3,6-dimethyl-4-hydroxy-2-methoxybenzaldehyde로 확인하였다.¹⁴⁾

화합물 4의 ¹H-NMR spectrum은 화합물 3의 signal들과 매우 유사하였으나 AB type의 aromatic proton 두개가 관측되었고 이들의 coupling constant value (J = 2.4 Hz)로 두개의 proton들이 서로 meta 위치에 있음을 알 수 있었다. 또한 화합물 3에서 methyl group이 2개가 관측된 반면 화합물 4에서는 한 개만 관측하였다. HMBC 실험을 통해 δ_H 3.89 (7-OCH₃)이 δ_C 173.5 (C-7) carbonyl carbon과 상관관계를 확인함으로써 화합물 4은 화합물 3의 7번 탄소(C-7) 위치에 aldehyde 대신 δ_H 3.89 (3H, s, 7-OCH₃)에서 보여진 methoxy group이 치환된 구조임을 알 수 있었다. 화합물 4의 NMR결과들과 문헌의 데이터와 비교하여 2,4-dihydroxy-6-methylbenzoate로 확인하였다.¹⁵⁾

이전의 연구에서 교모 세포 종 줄기세포(Glioma Stem Cells)에 대한 강한 억제 작용이 보고된 화합물 1에 대한 자세한 구조 분석은 물리화학적 방법과 1D 및 2D NMR 분석법을 통하여 다시 한번 본 연구에 언급하였으며,¹¹⁾ 이번 연구에서 P. freycinetii의 메탄올 추출물로부터 화합물 1을 포함하여 처음으로 분리된 화합물들(2–4)에 대하여 여러 암세포 종에 대한 억제 실험을 진행하였다.

P. freycinetii로부터 분리된 화합물들은 B-16 melanoma, LLC, Hela cell들에 대하여 암세포 억제 실험을 실시하였고, 이들 중 화합물 1은 Hela cell에 대하여 6.25 µM ~ 50 µM까지 처리하였을 때 25 µM부터 농도 의존적으로 암세포 억제 활성을 보였다. 그러나, 나머지 암세포주들에서는 활성을 나타내지 않았다. 특히, 50 µM 처리된 농도에서 Hela 세포에 대하여 43%로 중간 정도의 억제 활성을 보였다(Fig. 3).

Hopane-type triterpene 화합물들의 암세포 억제에 대한 많은 연구가 이루어져 있지는 않지만 몇몇 연구들을 살펴보면, Sichaem 등(2019)의 연구에서 Parmotrema sancti-angelii로부터 여러 hopane-type triterpenoid들을 분리하였는데 이들 중 6α-acetoxyhopane-16β,22-diol 화합물이 HepG2, NCI-H400 그리고 MCF-7cell에서 IC₅₀ 값이 각각 52.67, 77.86, 47.08 µg/mL로 세포독성 효과를 보였고,¹⁶⁾ 작은 땅 빈대 식물로 알려진 Euphorbia peplus에서 분리된 Friedo-hopane type triterpene에서는 C-22번위치의 OH group이 항암 활성에 중요한 역할을 하는 것으로 보고되었다.¹⁷⁾ Wang 등(2009)의 연구에서는 내염성 균류, Aspergillus variecolor B-17로부터 hopane-type triterpenoid들을 분리하였고, 이들 중 C-2번 위치에 OH group이 치환된 형태의 2-hydroxydiplopterol 화합물이 K562 cell에 대해(IC₅₀ 22 µM)의 농도로 억제 활성이 보고되었다.¹⁸⁾

본 연구에서 화합물 1과 구조적으로 유사한 2번 화합물에서는 활성을 보이지 않았다. 이는 화합물 1과 비교하였을 때 7번 탄소 위치에서 acetyl group보다 OH group이 치환되어 있을 때 Hela cell에 대한 억제 활성이 강함을 유추할 수 있다.

결 론

P. freycinetii의 메탄올 추출물로부터 얻은 Hex 분획물에 대하여 open column chromatography등 여러 분리법을 사용하여 기존에 보고된 7β,22-dihydroxyhopane (1) 외에, 7β-acetoxy-22-hydroxyhopane (2), 3,6-dimethyl-4-hydroxy-2-methoxybenzaldehyde (3), 2,4-dihydroxy-6-methylbenzoate (4) 화합물들을 처음으로 분리하였다.

분리된 화합물들을 B16 melanoma, LLC 및 Hela cell에 대하여 cytotoxicity 실험을 실시한 결과 화합물 1번에만 Hela cell을 농도 의존적으로 억제하는 것을 발견하였다. 본 연구 결과 및 이전의 관련 유도체들의 연구들로부터 앞으로 다양한 hopane-type triterpene 화합물들에 대한 구조 활성 연구들이 필요해 보이며, 본 연구를 바탕으로 Hela cell을 포함한 다양한 암세포들에 대하여 이들의 성장을 억제하는 선도 화합물로서의 역할이 기대된다.

Acknowledgments

본 연구는 극지연구소의 KOPRI (PN25170) 과제의 지원을 받아 수행 되었다.

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