국수나무 가지의 트리테르페노이드 유도체

국수나무(Stephanandra incisa (Thunb.) Siebold et Zabel)는 장미과(Rosaceae)에 속하는 낙엽활엽관목으로, 동아시아의 난대에서 온대에 걸쳐 중국 동부, 일본 동북부, 대만, 그리고 한국 전역에 널리 분포한다.¹⁾ 주로 산지의 저지대 또는 숲 가장자리에 자생하며, 양지와 음지를 가리지 않고 내한성과 내건성이 강하여 다양한 환경에 높은 적응력을 보인다.²⁾ 높이 1~2.5 m로 자라며 가지가 많이 나와 밑으로 처지면서 덤불 형태를 이루고, 잔가지는 가늘고 둥글며 잔털 또는 선모가 있다.¹⁾ 줄기의 골 속 모양이 국수와 같다고 하여 국수나무라 불리며, 조경수로도 활용된다.³⁾ 국수나무 속은 전 세계적으로 5종이 알려져 있으며, 중국에 2종, 일본에 2종, 대만에 1종, 한국에 1종이 생육하고 있다^4-7). 장미과 식물은 triterpenoid, flavonoids, phenolic 화합물 등 다양한 이차대사산물을 함유하는 것으로 알려져 있으며, 특히 triterpenoid는 항염, 항산화, 항암 등의 생리활성이 보고되어 천연물 신약 개발의 주요 소재로 주목받고 있다. 그러나 국수나무에 대한 성분 분리 연구는 현재까지 보고된 바 없어, 화학적 프로파일이 전혀 규명되지 않은 상태이다. 이에 본 연구에서는 국수나무 가지의 80% 메탄올 추출물로부터 triterpenoid을 분리하고 동정하여 국수나무의 화학적 조성을 밝히고, 해당 성분의 기초 자료를 제공하고자 하였다.

재료 및 방법

실험재료 − 본 연구에서 사용된 국수나무는 서울대학교 약학대학 부속 약초원에서 2022년 1월에 채집하였다. 강원대학교 약학대학에 보관(KNUSI-01)하였다.

기기 및 시약 − 질량분석데이터는 Thermo사의 Orbitrap Exploris120을 이용하여 측정하였다. NMR spectra는 Brucker사의 Avance II 600을 이용하여 측정하였다. 화합물의 분리는 Merck 사의 silica gel (63~200 μm)을 이용한 open column chromatography와 Teledyne Isco사의 CombiFlash® Flash chromatography system을 이용하여 RediSep® column으로 수행하였다. TLC 분석은 Merck사의 Kieselgel 60 F254와 RP F254s plates를 사용하였다. 컬럼크로마토그래피에 사용한 유기용매는 따로 언급이 없는 한 대정화금의 extra pure grade를 한번 증류한 것을 사용하였다. 기타 시약은 analytical grade를 사용하였다.

추출 및 분획 − 건조된 국수나무의 가지 6.1 kg을 80% MeOH로 3시간 3회 반복하여 추출하였다. 추출액을 필터 후에 감압 농축기로 농축을 진행하여 추출물 590.8 g을 얻었다. 추출물을 물에 현탁하여 n-hexane (16.0 g), EtOAc (61.5 g), n-BuOH (123.4 g), H₂O (312.6 g) 순으로 분획을 진행하였다.

국수나무 가지의 EtOAc 분획물로부터 화합물 분리 − 국수나무 가지의 EtOAc 분획물(61.5 g)을 MPLC silica gel column으로 n-hexane:EtOAc (9:1→8:2→6:4→4:6→2:8) 및 DCM:MeOH (8:2→4:6→2:8) 용매시스템을 이용해 분획하여 SIE1~SIE6을 얻었다. SIE5 (55.12 g)를 MPLC의 RP-C18 column으로 MeOH:H₂O (1:9→2:8→4:6→6:4→8:2→MeOH)로 재분리하여 SIE5-1~SIE5-4를 얻었고, SIE5-4 (23.7 g)를 다시 MPLC의 silica gel column (n-hexane:EtOAc 10:1→8:2→6:4→4:6→2:8→MeOH)로 분획하여 SIE5-4-1~SIE5-4-5를 얻었다. SIE5-4-1 분획을 MPLC의 RP-C18 column (MeOH:H₂O 5:1→10:1→15:1→MeOH)으로 재분리하여 SIE5-4-1-1~SIE5-4-1-5로 나누었고, SIE5-4-1-4를 silica gel open column chromatography (n-hexane:EtOAc 9:1→4:6→EtOAc→MeOH)로 분획하여 화합물 1 (53.6 mg)을 얻었다. SIE5-4-2를 MPLC의 RP-C18 column (MeOH:H₂O 3:1→5:1→8:1→MeOH)으로 분리하여 화합물 2 (8.0 mg), 3 (12.9 mg)을 얻었다. SIE5-4-3을 MPLC의 RP-C18 column (MeOH:H₂O 4:1→7:1→10:1→MeOH) 및 silica gel column chromatography로 분리하여 화합물 4 (5.1 mg), 5 (2.7 mg), 6 (1.3 mg)을 얻었다. SIE5-4-4를 MPLC RP-C18 column (MeOH:H₂O 4:1→8:1→12:1→MeOH)으로 분리하고 분취용 HPLC (MeOH:H₂O 85:15, 유속 10 mL/min)로 정제하여 화합물 7 (6.7 mg), 8 (2.5 mg)을 얻었다.

Compound 1 − Amorphous white powder; C₃₂H₅₀O₄; ESI-MS: m/z 497.3631 [M-H]^-; ¹H-NMR (600 MHz, chloroform-d): see Table I; ¹³C-NMR (150 MHz, chloroform-d): see Table I.

Table I.

NMR spectra data for compounds 1-5

Compound 2 − Amorphous white powder; C₃₂H₅₀O₅; ESI-MS: m/z 513.3580 [M-H]^-; ¹H-NMR (600 MHz, chloroform-d): see Table I; ¹³C-NMR (150 MHz, chloroform-d): see Table I.

Compound 3 − Amorphous white powder; C₃₀H₄₈O₄; ESI-MS: m/z 471.3474 [M-H]^-; ¹H-NMR (600 MHz, pyridine-d₅): see Table I; ¹³C-NMR (150 MHz, pyridine-d₅): see Table I.

Compound 4 − Amorphous white powder; C₃₀H₄₈O₅; ESI-MS: m/z 487.3423 [M-H]^-; ¹H-NMR (600 MHz, methanol-d₄): see Table I; ¹³C-NMR (150 MHz, methanol-d₄): see Table I.

Compound 5 − Amorphous white powder; C₃₀H₄₈O₅; ESI-MS: m/z 487.3420 [M-H]^-; ¹H-NMR (600 MHz, methanol-d₄): see Table I; ¹³C-NMR (150 MHz, methanol-d₄): see Table I.

Compound 6 − Amorphous white powder; C₃₀H₄₆O₄; ESI-MS: m/z 469.3318 [M-H]^-; ¹H-NMR (600 MHz, methanol-d₄): see Table II; ¹³C-NMR (150 MHz, methanol-d₄): see Table II.

Table II.

NMR spectra data for compounds 6-8

Compound 7 − Amorphous white powder; C₃₀H₄₈O₄; ESI-MS: m/z 471.3473 [M-H]^-; ¹H-NMR (600 MHz, methanol-d₄): see Table II; ¹³C-NMR (150 MHz, methanol-d₄): see Table II.

Compound 8 − Amorphous white powder; C₃₀H₄₈O₃; ESI-MS: m/z 455.3525 [M-H]^-; ¹H-NMR (600 MHz, chloroform-d): see Table II; ¹³C-NMR (150 MHz, chloroform-d): see Table II.

결과 및 고찰

화합물 1-8은 ¹H-NMR, ¹³C-NMR, HMBC, ESI-MS 등의 분광학적 데이터를 문헌치와 비교하여 구조를 동정하였으며, 각 화합물의 구조적 특징에 따라 ursane, oleanane, lupane 계열의 triterpene 골격으로 분류하였다(Fig. 1).

Fig. 1.

Chemical structures of the compounds 1-8.

화합물 1은 무정형 백색 분말로 ESI-MS (m/z 497.3631 [M-H]^-)의 값을 통해 분자식을 C₃₂H₅₀O₄로 확인하였다. ¹H 및 ¹³C-NMR spectrum에서 δ_C 125.7 (C-12)과 δ_C 137.9 (C-13)의 olefin carbon signal 및 δ_H 0.95 (3H, d, J=6.7 Hz, H-30)의 doublet methyl proton signal을 통해 ursane 계열의 triterpene 골격임을 판단하였다. ¹H-NMR spectrum에서 1개의 olefin methine proton signal (δ_H 5.24, 1H, t, J=3.6 Hz, H-12)과 1개의 oxygenated methine proton signal (δ_H 4.50, 1H, dd, J=5.9, 10.2 Hz, H-3), 그리고 1개의 acetyl proton signal (δ_H 2.04, 3H, s, -COCH₃, H-32)을 확인하였다. 6개의 methyl proton signal (δ_H 1.07, 0.96, 0.95, 0.87, 0.86, 0.85, 0.77)을 확인하였다. ¹³C-NMR spectrum에서 1개의 carboxyl carbon signal (δ_C 182.9, C-28)과 1개의 oxygenated-methine carbon signal (δ_C 80.9, C-3), 2개의 acetyl carbon signal (δ_C 171.0, C=O, C-31; δ_C 21.3, -COCH₃, C-32)을 확인하였다. HMBC spectrum에서 δ_C 171.0 (C=O, C-31)과 δ_C 4.50 (1H, dd, J=5.9, 10.2 Hz, H-3)의 상관관계를 통해 acetyl기가 C-3 위치에 결합되어 있음을 확인하였다. 이상의 분광학적 데이터를 문헌치와 비교한 결과, 화합물 1을 ursolic acid 3-acetate로 동정하였다.⁸⁾

화합물 2는 무정형 백색 분말로 ESI-MS (m/z 513.3580 [M-H]^-)에서 분자식 C₃₂H₅₀O₅를 확인하였으며, hydroxyl기가 1개 추가된 구조를 예상하였다. ¹H-NMR 및 ¹³C-NMR spectrum은 화합물 1과 유사한 패턴을 보였으나, δ_C 73.2에서 oxygenated-quaternary carbon signal (C-19)이 추가로 관찰되어 C-19 위치에 hydroxyl기의 존재를 확인하였다. ¹H-NMR spectrum에서 δ_H 5.34 (1H, t, J=3.8 Hz, H-12)의 olefin methine proton signal, δ_H 4.50 (1H, dd, J=6.3, 9.7 Hz, H-3)의 oxygenated-methine proton signal, δ_H 2.05 (3H, s, -COCH₃, H-32)의 acetyl proton signal을 확인하였다. 7개의 methyl proton signal (δ_H 1.24, 1.21, 0.96, 0.94, 0.87, 0.85, 0.72)을 확인하였다. ¹³C-NMR spectrum에서 탄소 32개를 확인하였고, δ_C 183.7 (C-28)의 carboxyl carbon, δ_C 138.1 (C-13)과 δ_C 129.5 (C-12)의 olefin carbons, δ_C 81.1 (C-3)의 oxygenated-methine carbon, δ_C 171.2 (C=O, C-31)과 δ_C 21.5 (-COCH₃, C-32)의 acetyl carbon signal을 확인하였다. H-30의 doublet 양상과 C-12/C-13의 olefin carbon signal을 통해 ursane 계열임을 확인하고, 문헌치와 비교하여 화합물 2를 pomolic acid 3-acetate로 동정하였다.⁹⁾

화합물 3은 무정형 백색 분말로 ESI-MS (m/z 471.3474 [M-H]^-)에서 분자식이 C₃₀H₄₈O₄로 확인하고, 화합물 2보다 42 mass unit 낮은 것을 나타내어, acetyl기(C₂H₂O)가 제거된 hydroxyl 형태의 구조를 예상하였다. 이는 ¹H-NMR spectrum에서 화합물 1과 2에서 관찰되었던 δ_H 2.04-2.05 영역의 acetyl proton signal이 소실되었고, ¹³C-NMR spectrum에서도 δ_C 171.0-171.2 (C=O) 및 δ_C 21.3-21.5 (-COCH₃)의 acetyl carbon signal이 관찰되지 않았다. ¹H-NMR spectrum에서 δ_H 5.64 (1H, t-like, H-12)의 olefin methine proton signal과 δ_H 3.46 (1H, dd, J=4.9, 11.2 Hz, H-3)의 oxygenated-methine proton signal을 확인하였다. 7개의 methyl proton signal (δ_H 1.76, 1.48, 1.26, 1.15, 1.14, 1.05, 0.94)을 확인하였다. ¹³C-NMR spectrum에서 탄소 30개를 확인하였고, δ_C 181.2 (C-28)의 carboxyl carbon, δ_C 140.5 (C-13)과 δ_C 128.5 (C-12)의 olefin carbons, δ_C 78.7 (C-3)의 oxygenated-methine carbon, δ_C 73.2 (C-19)의 oxygenated-quaternary carbon signal을 확인하였다. 문헌치와 비교한 결과, 화합물 3을 pomolic acid로 동정하였다.⁹⁾

화합물 4는 무정형 백색 분말로 ESI-MS (m/z 487.3423 [M-H]^-)에서 분자식 C₃₀H₄₈O₅을 확인하고, 화합물 3보다 16 mass unit 높은 값으로 추가적인 hydroxyl기의 존재를 예상하였다. ¹³C-NMR spectrum은 화합물 3과 유사한 패턴이었으나, 화합물 3에서 C-2에 δ_C 67.2의 oxygenated-methine carbon signal이 새롭게 확인되어 2번 탄소에 hydroxyl기가 도입된 2,3,19-trihydroxy 구조를 예상하였다. ¹H-NMR spectrum에서 δ_H 5.30 (1H, t, J=3.7, H-12)의 olefin methine proton signal과 δ_H 3.33 (1H, d, J=2.8 Hz, H-3)의 oxygenated-methine proton signal을 확인하였다. H-3의 coupling constant (J=2.8 Hz)로 H-2와 H-3가 equatorial-axial 관계인 것을 확인하였다. 7개의methyl proton signal (δ_H 1.36, 1.20, 1.00, 1.00, 0.94, 0.88, 0.80)을 확인하였다. ¹³C-NMR spectrum에서 탄소 30개를 확인하였고, δ_C 182.4 (C-28)의 carboxyl carbon, δ_C 140.1 (C-13)과 δ_C 129.4 (C-12)의 olefin carbons, δ_C 80.1 (C-3)과 δ_C 67.2 (C-2)의 oxygenated-methine carbons, δ_C 73.6 (C-19)의 oxygenated-quaternary carbon signal을 확인하였다. 문헌치와 비교한 결과, 화합물 4를 euscaphic acid로 동정하였다.¹⁰⁾

화합물 5는 무정형 백색 분말로 화합물 4와 동일한 분자식 C₃₀H₄₈O₅ (ESI-MS m/z 487.3420 [M-H]^-)를 나타내어 이성질체 관계를 예상하였다. ¹H-NMR 및 ¹³C-NMR spectrum은 화합물 4와 매우 유사하였으나, A-ring의 C-2 및 C-3 위치에서 현저한 chemical shift 차이가 나타났다. 화합물 4와 비교해 C-2는 δ_C 67.2에서 δ_C 69.5로, C-3는 δ_C 78.7에서 δ_C 84.6으로 down-field로 이동하였으며, H-3 역시 δ_H 3.33 (d, J=2.8 Hz)에서 δ_H 2.93 (d, J=9.5 Hz)으로 변화하였다. 특히 H-3의 coupling constant가 2.8 Hz에서 9.5 Hz로 크게 증가한 것은 H-2와 H-3 사이의 배향이 equatorial-axial에서 axial-axial로 변화하였음을 의미하며, 이는 C-3 hydroxyl기의 입체배향이 α에서 β로 전환된 것을 지시한다. ¹H-NMR spectrum에서 δ_H 5.31 (1H, t, J=3.7, H-12)의 olefin methine proton signal과 7개의methyl proton signal (δ_H 1.35, 1.21, 1.03, 1.02, 0.94, 0.82, 0.81)을 확인하였다. ¹³C-NMR spectrum에서 탄소 30개를 확인하였고, δ_C 182.5 (C-28)의 carboxyl carbon, δ_C 140.2 (C-13)과 δ_C 129.2 (C-12)의 olefin carbons, δ_C 73.6 (C-19)의 oxygenated-quaternary carbon signal을 확인하였다. 문헌치와 비교한 결과, 화합물 5를 tormentic acid로 동정하였다.¹¹⁾

화합물 6은 무정형 백색 분말로 ESI-MS (m/z 469.3318 [M-H]^-)의 값을 통해 분자식 C₃₀H₄₆O₄를 확인하였다. 본 화합물은 화합물 3-5와 동일한 ursane 골격을 가지면서도 A-ring에서 특이적인 구조 변환이 관찰되었다. ¹³C-NMR spectrum에서 화합물 4, 5에서 각각 관찰되었던 C-2, C-3의 oxygenated carbon signal 대신, δ_C 157.3 (C-2)과 δ_C 134.1 (C-3)의 olefin carbon signal이 확인되어 A-ring에서 탈수 반응에 의한 이중 결합 형성이 일어났음을 알 수 있었다. ¹H-NMR spectrum에서 δ_H 5.76 (1H, br s, H-3)과 δ_H 5.62 (1H, br s, H-12)의 2개의 olefin methine proton signal이 확인되었으며, δ_H 4.59 (1H, d, J=14.9 Hz, H-1a)와 δ_H 4.46 (1H, d, J=14.9 Hz, H-1b)의 oxygenated methylene proton signal을 통해 C-1 위치에 hydroxymethyl기가 존재함을 확인하였다. 7개의 methyl proton signal (δ_H 1.72, 1.43, 1.18, 1.17, 1.12, 1.10, 0.99)을 확인하였다. ¹³C-NMR spectrum에서 δ_C 140.7 (C-13)과 δ_C 128.6 (C-12)의 olefin carbon signal을 확인하였다. δ_C 73.1 (C-19)과 δ_C 61.3 (C-1)에서 oxygenated carbon signal을 확인하여 hydroxyl기 2개의 존재를 예상하였다. C-28이 측정되지는 않았으나, 질량분석값에 근거한 분자식과 NMR데이터의 문헌치와 비교한 결과, 화합물 6을 hyptadienic acid로 동정하였다.¹²⁾

화합물 7은 무정형 백색 분말로 ESI-MS (m/z 471.3473 [M-H]^-)의 값을 통해 분자식 C₃₀H₄₈O₄를 확인하였다. 본 화합물은 앞서 동정한 ursane 계열 화합물들과 구별되는 중요한 특징을 보였다. 7개의 methyl proton signal이 모두 singlet으로 관찰되었다. ¹³C-NMR spectrum에서 C-13이 δ_C 145.4로 관찰되어 ursane 계열(δ_C 137-141)보다 현저히 down-field에 나타나는 oleanane 계열의 전형적인 값을 보였으며, C-12는 δ_C 122.9로 ursane 계열(δ_C 125-130)보다 up-field에서 확인되었다. ¹H-NMR spectrum에서 δ_H 5.49 (1H, br s, H-12)의 olefin methine proton signal과 δ_H 3.42 (1H, d, J=9.3 Hz, H-3)의 oxygenated-methine proton signal을 확인하였다. 나머지 methyl proton signal은 δ_H 1.30 (3H, s, H-27), δ_H 1.28 (3H, s, H-23), δ_H 1.10 (3H, s, H-26), δ_H 1.04 (3H, s, H-30), δ_H 1.02 (3H, s, H-24), δ_H 1.01 (3H, s, H-29), δ_H 0.96 (3H, s, H-25)으로 확인되었다. ¹³C-NMR spectrum에서 탄소 30개를 확인하였고, δ_C 180.8 (C-28)의 carboxyl carbon, δ_C 84.3 (C-3)과 δ_C 69.0 (C-2)의 oxygenated-methine carbon signal을 확인하였다. 문헌치와 비교한 결과, 화합물 7을 maslinic acid로 동정하였다.¹³⁾

화합물 8은 무정형 백색 분말로 ESI-MS (m/z 455.3525 [M-H]-)의 값을 통해 분자식 C₃₀H₄₈O₃을 확인하였다. 본 화합물은 화합물 1-7의 ursane 또는 oleanane 골격과는 전혀 다른 스펙트럼 양상을 보였다. 가장 주목할 만한 차이는 Δ12-olefin signal의 부재와 δ_H 4.74 (1H, d, J=2.3 Hz, H-29a) 및 δ_H 4.61 (1H, m, H-29b)에서 관찰되는 exocyclic methylene proton signal의 출현이다. ¹³C-NMR spectrum에서 이에 대응하는 δ_C 150.6 (C-20)의 olefin quaternary carbon과 δ_C 109.9 (C-29)의 olefin methylene carbon signal이 확인되어 lupane 계열의 isopropenyl기 존재를 확인하였다. ¹H-NMR spectrum에서 δ_H 3.19 (1H, dd, J=4.7, 11.5 Hz, H-3)의 oxygenated-methine proton signal과 6개의 methyl proton signal (δ_H 1.69, 0.97, 0.96, 0.94, 0.82, 0.75)을 확인하였다. ¹³C-NMR spectrum에서 1개의 oxygenated-methine carbon signal (δ_C 79.2, C-3)을 확인하였다. C-28의 carboxyl carbon은 직접 관찰되지 않았으나, 분자식 및 ESI-MS 데이터를 고려하여 carboxyl기의 존재를 추정하였다. 문헌치와 비교한 결과, 화합물 8을 betulinic acid로 동정하였다.¹⁴⁾

결론

본 연구에서는 국수나무(S. incisa) 가지의 EtOAc 분획으로부터 8종의 트리테르페노이드 화합물을 분리하였다. 화합물 1-6는 ursane-type, 7은 oleanane-type, 8은 lupane-type으로 확인되었다. 이들 화합물은 국수나무속 식물에서는 처음으로 분리 보고되는 성분들이다. 본 연구 결과는 국수나무의 화학적 프로파일링 및 성분 분류학적 기초 자료로서 가치가 있을 것으로 사료된다. 분리된 화합물들은 선행 연구에서 항염, 항산화, 항암 등의 활성이 보고된 triterpenoid로, 확인된 성분들이조성 결과는 장미과 내 근연속에서 보고된 triterpenoid 프로파일과의 비교 자료 및 향후 생리활성 및 소재화 연구의 출발점으로서 의미를 가진다.

Acknowledgments

본 연구는 농촌진흥청의 농업과학기술 공동연구사업(과제번호: RS-2022-RD010295)에 의해 수행한 결과이며, 또한 핵자기공명분광기 사용은 강원대학교 항암혁신신약개발 핵심연구지원센터(CFICDD)의 기술적 지원(2022R1A6C101A739)으로 수행되었으며, 지원에 감사드립니다.

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